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本试剂盒含有Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体，可以用于检测小鼠来源的相应一抗，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下可以观察到鲜艳的红色。

Cy3是近年新开发的一种红色荧光探针。它比绝大部分其它的红色荧光探针更加明亮，更加不容易淬灭，而且背景更低。Cy3的吸收(激发)和发射峰分别为550nm和570nm。

• 本试剂盒含有抗荧光淬灭封片液，可以使荧光更加持久。
  
• 操作简便，灵敏度高。

• 荧光物质均易发生淬灭，染色后需尽快进行荧光显微镜下的观察。如果不能及时观察可以4℃避光保存，但随着存放时间的延长可能会导致观察效果越来越差。
  
• 如果观察时发现荧光过弱，可以适当提高一抗的浓度或适当提高荧光标记抗体的浓度。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 免疫荧光染色的准备工作
  荧光标记二抗的稀释：将荧光标记的二抗按照1:100～1000的比例用本试剂盒提供的免疫荧光染色二抗稀释液进行稀释。
  根据荧光的强弱，其稀释比例可以适当地提高或降低。
  
• 贴壁细胞
  
  • 细胞爬片，PBST洗3次，每次5min。
    
  • 加入1mL预冷的固定液，室温固定10min或更长时间。
    
  • PBST洗3次，每次5min。
    
  • 0.1-0.5%Triton X-100室温通透10～15min。
    
  • PBST洗3次，每次5min。
    
  • 封闭液室温封闭30～45min。
    
  • 一抗室温孵育60min，为增强与一抗的结合，建议4℃孵育过夜，次日室温孵育60min。
    
  • PBST洗4次，每次5min。
    
  • 加入50μL稀释的荧光标记的二抗，避光孵育45～60min。
    
  • PBST洗3次，每次5min，期间适当注意避光操作。
    
  • 如有需要可进行DAPI或Hoechst复染细胞核。
    
  • 抗荧光淬灭封片液封片，指甲油密封盖玻片。
    
  • 荧光显微镜下可以观察到红色的荧光。
• 悬浮细胞
  
  • 离心收集细胞样品于1.5mL离心管中，去掉上清后轻轻弹散细胞。
    
  • 加入0.5mL固定液，混悬细胞，固定10min或更长时间。
    
  • 离心去除固定液，PBST洗3次，每次5min。
    
  • 0.1-0.5%Triton X-100室温通透10～15min。
    
  • PBST洗3次，每次5min。
    
  • 最后一次离心后吸除大部分液体并保留50μL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至防脱载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
    
  • 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
    
  • 封闭液室温封闭30～45min。
    
  • 一抗室温孵育60min，为增强与一抗的结合，建议4℃孵育过夜，次日室温孵育60min。
    
  • PBST洗4次，每次5min。
    
  • 加入50μL稀释的荧光标记的二抗，避光孵育45～60min。
    
  • PBST洗3次，每次5min，期间适当注意避光操作。
    
  • 如有需要可进行DAPI或Hoechst复染细胞核。
    
  • 抗荧光淬灭封片液封片，指甲油密封盖玻片。
    
  • 荧光显微镜下可以观察到红色的荧光。
• 冰冻切片
  
  • 用固定液固定10min或更长时间。
    
  • PBST洗3次，每次5min。
    
  • 封闭液室温封闭30～45min。
    
  • 一抗室温孵育60min，为增强与一抗的结合，可以4℃孵育过夜，次日室温孵育60min。
    
  • PBST洗4次，每次5min。
    
  • 加入50μL稀释的荧光标记的二抗，避光孵育45～60min。
    
  • PBST洗3次，每次5min，期间适当注意避光操作。
    
  • 如有需要可进行DAPI或Hoechst复染细胞核。
    
  • 抗荧光淬灭封片液封片，指甲油密封盖玻片。
    
  • 荧光显微镜下可以观察到红色的荧光。
• 石蜡切片
  
  • 切片常规脱蜡至水。
    
  • 根据每一种抗体的要求，对组织进行相应的抗原修复，也可选用本公司生产的抗原修复液。
    
  • PBST洗3次，每次5min。
    
  • 封闭液室温封闭30～45min。
    
  • 一抗室温孵育60min，为增强与一抗的结合，可以4℃孵育过夜，次日室温孵育60min。
    
  • PBST洗4次，每次5min。
    
  • 加入50μL稀释的荧光标记的二抗，避光孵育45～60min。
    
  • PBST洗3次，每次5min，期间适当注意避光操作。
    
  • 如有需要可进行DAPI或Hoechst复染细胞核。
    
  • 抗荧光淬灭封片液封片，指甲油密封盖玻片。
    
  • 荧光显微镜下可以观察到红色的荧光。